ה ההבדל העיקרי בין מיצוי ה- DNA ל- RNA היא שרמת ה- pH של מיצוי DNA הוא pH 8 ואילו רמת ה- pH של מיצוי RNA היא pH 4.7. דנ"א נוטה לדלג ולעבור לשלב האורגני ב pH חומצי. ב- pH אלקליין, ה- RNA עובר הידרוליזה אלקליין עקב הימצאות 2 ′ OH בסוכר הריבוז.

מיצוי DNA ו- RNA הם שני ההליכים המעורבים בבידוד וטיהור של חומצות גרעין מתאי הרקמות. שני ההליכים מורכבים משלושה שלבים. DNA ו- RNA באיכות טובה ממלאים תפקיד קריטי בניסויים בביולוגיה מולקולרית, ביוטכנולוגיה, גנומיקה ואפידמיולוגיה.

אזורי מפתח מכוסים

1. מהי מיצוי DNA - הגדרה, נוהל 2. מהי מיצוי RNA - הגדרה, נוהל 3. מה הדמיון בין חילוץ DNA ו- RNA - מתווה של תכונות נפוצות 4. מה ההבדל בין חילוץ DNA ו- RNA - השוואה בין הבדלים מרכזיים

מונחי מפתח: ניתוח תאים, דנטורציה של חלבונים, מיצוי DNA, pH, משקעים, מיצוי RNA

מהי מיצוי DNA

מיצוי DNA הוא הליך הבידוד והטיהור של ה- DNA. ניתן לבודד DNA מדם, דגימות רקמות קפואות או גושי רקמות פרפין. שלושת השלבים של מיצוי הדנ"א הם תמוגה של תאים, בידוד ה- DNA ומשקעים. במהלך פירוק התא, מחסומי קרום התא כגון קרום התא וממברנות הגרעין נפרצות על מנת לחשוף DNA. השלב הבא הוא הסרת שומנים ממברנה מהמדגם. לבסוף, משקעים של DNA כוללים הסרת חלבונים הקשורים ל- DNA על ידי פרוטאז והסרת RNA על ידי RNase.

איור 1: הליך מיצוי DNA

פרוטוקולים בסיסיים של מיצוי DNA

להלן הפרוטוקולים הבסיסיים של מיצוי DNA.

1. תמוגה של תא עם מאגר תמונת התא לליזת ממברנות התא

2. שומנים מתפרקים באמצעות חומרי ניקוי וחומרים פעילי שטח

3. עיכול חלבונים על ידי הוספת פרוטאז

4. עיכול RNA על ידי הוספת RNase

5. הפרדת פסולת התא, חלבונים מתעכלים, שומנים ו- RNA על ידי הוספת מלח מרוכז ואחריו צנטריפוגה

6. משקעים אתנול של DNA עם אתנול קר כקרח או איזופרופנול. ניתן להשתמש בחוזק היוני של נתרן אצטט לשיפור המשקעים. ה- DNA המזורז מופיע כחוטים בתמיסה הסופית.

איור 2: DNA שחולץ

ניתן להשתמש במיצוי פנול-כלורופורם גם להפרדת DNA מחלבונים. כאן, פנול מפריך את החלבונים שבמדגם, וה- DNA נשאר בשלב המימי בסוף החילוץ. ובשלב האורגני, אתה יכול למצוא את החלבונים המפוחתים. שיטה נוספת לחילוץ DNA היא טיהור המיני -טור. כאן, קישור ה- DNA לעמודה מסתמך על ה- pH וריכוז המלח של המאגר.

מהי מיצוי RNA

מיצוי RNA מתייחס לתהליך טיהור ה- RNA מדגימות. השיטה המקובלת לחילוץ RNA נקראת מיצוי guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform. Guanidinium thiocyanate מכיל חלבונים. יתר על כן, הוא משבש את קישור המימן של מולקולות המים ומשמש כסוכן הכאוטרופי. מגיב מיוחד משמש במיצוי ה- RNA הנקרא מגיב תלת-ממדי. הוא מכיל guanidinium thiocyanate, פנול וסודיום אצטט. מטרת השלבים הבסיסיים של מיצוי RNA דומה לזו של מיצוי DNA. הפרוטוקול לחילוץ RNA מתואר להלן.

1. תאים נשטפים עם PBS קר כקרח כדי לשמור על האוסמולריות של התאים.

2. לשאוב את התאים homogenize את המדגם עם Tri-reagent.

3. מוסיפים כלורופורם ומנערים.

4. צנטריפוגה עלולה לגרום לשלוש שכבות. השכבה העליונה היא השכבה המימית, שהיא צלולה. השכבה האמצעית או האינטרפאז מכילים את ה- DNA המוזרם. השכבה התחתונה היא השכבה האורגנית, שהיא ורודה.

5. מסירים את השכבה המימית ומוסיפים איזופרופנול. צנטריפוגה עלולה לגרום לגלולה.

6. שטפו את הגלולה באתנול 75%. ייבש את הגלולה באוויר.

7. ממיסים את הגלולה במאגר TE או במים.

איור 3: הפקת פנול-כלורופורם של RNA

מיצוי RNA מתבצע בדרך כלל ב- pH מתחת 7. ב- pH אלקליין, RNA נוטה להיפגע על ידי הידרוליזה אלקליין בשל נוכחותה של קבוצת OH במיקום 2 ′ של סוכר הריבוזה. בנוסף, RNA נוטה להישאר בשלב המימי ב- pH חומצי. מצד שני, ה- DNA נוטה להתנתק ולעבור לשלב האורגני ב pH חומצי. לכן ניתן לבצע מיצוי DNA בערך ב- pH 8. בערך ה- DNA בנוי מסוכר deoxyribose ואינו עובר הידרוליזה אלקליין.

קווי דמיון בין חילוץ DNA ו- RNA

ההבדל בין חילוץ DNA ו- RNA

הַגדָרָה

מיצוי DNA: הליך בידוד וטיהור של DNA

חילוץ RNA: תהליך טיהור RNA מדגימות

סוג חומצת הגרעין המופק

מיצוי DNA: DNA

חילוץ RNA: RNA

pH

מיצוי DNA: בוצע בשמונה

חילוץ RNA: בוצע ב- 4.7

צעדים

מיצוי DNA: שבירת קרום התא או תמוגה של התא, הסרת שומני הממברנה והזרקת ה- DNA

חילוץ RNA: תמוגה של תאים, מיצוי guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform, הכנה עם איזופרופנול

שימוש במים שטופלו ב- DEPC

מיצוי DNA: אף אחד

חילוץ RNA: כל הריאגנטים מוכנים במים שטופלו ב- DEPC

אִחסוּן

מיצוי DNA: ניתן לחלץ את ה- DNA לפני והוא מאוחסן בקבוצות

חילוץ RNA: מיצוי RNA מתבצע ממש לפני ההליכים במורד הזרם

אחסון לטווח ארוך

מיצוי DNA: ב -20 מעלות צלזיוס

חילוץ RNA: ב -80 מעלות צלזיוס

סיכום

מיצוי הדנ"א מתבצע ב pH 8. דנ"א נוטה לעבור לשלב האורגני כשהוא מתגרה ב pH חומצי. עם זאת, מיצוי RNA מתבצע ב pH נמוך כדי למנוע השפלה על ידי הידרוליזה אלקליין. המטרה הבסיסית של השלבים של מיצוי ה- DNA ו- RNA הן דומות. ההבדל העיקרי בין מיצוי DNA ו- RNA הוא תנאי ה- pH המשמשים בכל סוג מיצוי.

התייחסות:

1. "יסודות מיצוי ה- DNA". ספר הלימוד הווירטואלי של Alaska BioPREP, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, זמין כאן 2. "בידוד RNA ופרוטוקול שעתוק הפוך: תאים בתרבות." abcam, זמין כאן

באדיבות התמונה:

1. "איור 17 01 02" מאת CNX OpenStax-(CC BY 4.0) באמצעות Commons Wikimedia 2. "חילוץ DNA" מאת Joo Nath-יצירה משלו (CC BY-SA 4.0) באמצעות Commons Wikimedia 3. "מיצוי PhOH-CHCl3" מאת סקווידוניוס (שיחה)-יצירה משלו (טקסט מקורי: תוצרת עצמית) (תחום ציבורי) באמצעות Commons Wikimedia