ההבדל העיקרי - PCR לעומת QPCR

PCR (תגובת שרשרת פולימראז) ו- qPCR (PCR כמותי) הן שתי טכניקות המשמשות בביוטכנולוגיה להגברת ה- DNA למטרות שונות. PCR היא טכניקה פשוטה יחסית. qPCR ידועה גם בשם PCR בזמן אמת אוֹ PCR דיגיטלי. ה ההבדל העיקרי בין PCR ל- qPCR זה PCR היא טכניקה איכותית ואילו qPCR היא טכניקה כמותית. PCR מאפשר לקרוא את התוצאה כ"נוכחות או היעדרות ". אך ב- qPCR, כמות ה- DNA המוגברת בכל מחזור נמדדת. אם משתמשים ב- RNA ב- PCR, הטכניקה ידועה בשם RT-PCR (שעתוק הפוך PCR), ואם משתמשים ב- RNA ב- qPCR, הטכניקה ידועה בשם qRT-PC.

אזורי מפתח מכוסים

1. מהו PCR - הגדרה, תהליכים, שימושים 2. מהו QPCR - הגדרה, תהליכים, שימושים 3. מה הדמיון בין PCR ל- QPCR - מתווה של תכונות נפוצות 4. מה ההבדל בין PCR ל- QPCR - השוואה בין הבדלים מרכזיים

מונחי מפתח: אלקטרופורזה של ג'ל אגרוזה, אמליקונים, פולימראז DNA, צבע ניאון, PCR, בדיקות, qPCR, RT-qPCR

מהו PCR

PCR מתייחס לטכניקה בביוטכנולוגיה המאפשרת ניתוח של רצף DNA קצר על ידי הגברת קטע DNA שנבחר. זוהי שיטה רגישה יחסית מכיוון שכרכים קטנים מאוד נדרשים על ידי תגובה אחת. הטכניקה מבוססת על היכולת של DNA פולימראז לסנתז גדילים חדשים של DNA לגדיל התבנית המוצע באופן משלים. תערובת התגובה של PCR מורכבת מפולימראז DNA, נוקלאוטידים DNA, פריימרים, תבנית ה- DNA שיש להגביר ומגנזיום. ההגברה מתבצעת בתוך תרמוציקלר. פולימראז DNA צריך להיות עמיד בחום שכן משתמשים בתגובה זו בטמפרטורות גבוהות. שני סוגי פולימראז ה- DNA המשמשים ב- PCR הם פולימראז Taq DNA ופולימראז Pfu DNA. Taq DNA פולימראז נמצא בשימוש נרחב ב- PCR.

פולימראז DNA דורש גדיל DNA קיים קיים בקצה 3 'כדי לסנתז גדיל חדש. מכאן, שמתווסף תחל oligonucleotide לתערובת התגובה לצורך התחלת סינתזת ה- DNA. הדרישה של פריימר ב- PCR מאפשרת הגברה של אזור ספציפי בלבד בתבנית. רצף המטרות מוקף בפריימרים קדימה ואחורה. בסוף ה- PCR, עותקים חדשים של רצף DNA ספציפי, הנקראים amplicons, מצטברים במיליארדים. יש לייעל את רכיבי ה- PCR בצורה כזו לשיפור ביצועי ה- PCR תוך צמצום הכשל. תגובת ה- PCR הסטנדרטית מוצגת באיור 1.

איור 1: PCR

שלבי ה- PCR

שלושת השלבים של ה- PCR מתוארים להלן.

1. דנטורציה -תבנית ה- DNA הדו-גדילית מופרדת לשני גדילים בודדים על ידי חימום ל-94-95 מעלות צלזיוס.
2. רִכּוּך - פריימרים קדימה ואחורה נקשרים לרצפים המשלימים בתבנית. הטמפרטורה תלויה בטמפרטורת ההיתוך של שילוב הפריימר.
3. הארכת פריימר - אנזים DNA פולימראז מאריך כל פריימר בסוף 3'ם שלהם על ידי הוספת בסיסים משלימים לגדיל הגדל. הטמפרטורה האופטימלית של Taq פולימראז, כלומר 72 ° C, משמשת כטמפרטורה בשלב ההרחבה. זמן ההרחבה תלוי במספר זוגות הבסיס בגדיל התבנית.

שלושת השלבים חוזרים על עצמם במשך 28-35 פעמים. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוזה משמשת לפילוג הגודל של מוצרי PCR. המוצר מוכתם על ידי אתידיום ברומיד והוא נצפה תחת UV. ניתן להשתמש במוצר ה- PCR או ב- DNA המוגבר בשיבוט, רצף או גנוטיפינג.

מהו QPCR

QPCR מתייחס לטכניקה בביוטכנולוגיה המאפשרת איתור, אפיון וכימות של חומצות גרעין ליישומים שונים. מכאן שמדובר בסוג של PCR כמותי. ניתן להשתמש הן ב- DNA והן ב- RNA כ- qPCR. אם RNA משמש כתבנית, יש לתמלל אותו הפוך לראשונה ל- cDNA. לפיכך, סוג זה של qPCR ידוע בשם RT-qPCR. ה- PCR המסורתי מתבצע עבור cDNA או דגימת DNA רגילה. עם זאת, ב- qPCR, צבעי ניאון משמשים לסימון המוצר PCR בכל שלב של מחזור ה- PCR. זה מאפשר איסוף נתונים עם התקדמות ה- PCR, ומאפשר כימות של amplicons במהלך השלב האקספוננציאלי של ה- PCR. סוג הצבע העיקרי המשמש ב- qPCR הוא SYBR ירוק. הצבע נקשר ל- DNA הדו-גדילי. כאשר הקרינה גדלה באופן פרופורציונאלי עם כמות ה- DNA המוגבר, ניתן לבצע את הכימות ב"זמן אמת ". החיסרון העיקרי בשימוש בצבע הוא בכך שהוא מאפשר כימות של מוצר ספציפי אחד במדגם. בנוסף לצבעים, ניתן להשתמש בבדיקות גם בתהליך הכימות. בדיקות TaqMan הן אחד מהסוגים העיקריים של בדיקות אוליגונוקלאוטיד המשמשות ב- qPCR, ותהליך פליטת הקרינה מוצג באיור 2.

איור 2: בדיקת TaqMan

ניתן לעצב בדיקות באופן כזה לאתר מספר מוצרי PCR בתוך אותה מדגם. בדיקת TaqMan היא אחד הסוגים העיקריים של בדיקות הידרוליזה; שילוב בדיקה זו במוצר ה- PCR חושף את הפלואורופור, פולט את הקרינה. צבעי ניאון ספציפיים יותר למוצר ה- PCR. מכאן שהם משמשים ברוב מבחני האבחון לאיתור המוצר PCR.

קווי דמיון בין PCR ל- QPCR

ההבדל בין PCR ל- QPCR

הַגדָרָה

PCR: PCR היא טכניקה בביוטכנולוגיה המאפשרת ניתוח של רצף DNA קצר על ידי הגברת קטע DNA שנבחר.

QPCR: QPCR היא טכניקה בביוטכנולוגיה המאפשרת איתור, אפיון וכימות של חומצות גרעין ליישומים שונים.

כמותית/איכותית

PCR: PCR היא טכניקה איכותית.

QPCR: QPCR היא טכניקה כמותית.

זיהוי המוצר

PCR: המוצר מזוהה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose ב- PCR.

QPCR: ניתן לזהות את המוצר בכל מחזור הגברה ב- qPCR.

אוסף נתונים

PCR: הנתונים נאספים בסוף התגובה ב- PCR.

QPCR: הנתונים נאספים במהלך השלב האקספוננציאלי של התגובה ב- qPCR.

פתרון הבעיה

PCR: ל- PCR יש רזולוציה גרועה מאוד.

QPCR: ל- QPCR יש רזולוציה גבוהה מאוד.

צבעים

PCR: PCR משתמש באתידיום ברומיד כדי להכתים את המוצר במהלך PCR.

QPCR: QPCR משתמש בצבעי ניאון לאיתור המוצר.

זְמַן

PCR: PCR היא שיטה שדורשת יותר זמן.

QPCR: QPCR פחות זמן רב.

RNA

PCR: RT-PCR הוא סוג ה- PCR שמשתמש ב- RNA כתבנית.

QPCR: RT-qPCR הוא סוג qPCR שמשתמש ב- RNA כתבנית.

תַפְקִיד

PCR: PCR משמש לאיתור נוכחות או היעדרות של שברים גנומיים מסוימים.

QPCR: QPCR משמש לכימות שבר מסוים במדגם.

סיכום

PCR ו- qPCR הם שני סוגים של טכניקות המשמשות בביוטכנולוגיה להגברת ה- DNA למטרות שונות. PCR היא שיטת ההגברה המסורתית המשמשת לזיהוי נוכחות או היעדר של שבר DNA. QPCR משמש לכימות שבר מסוים במדגם. לפיכך, PCR היא טכניקה איכותית ואילו qPCR היא טכניקה כמותית. זהו ההבדל העיקרי בין PCR ל- qPCR.

התייחסות:

1. "QPCR לעומת PCR דיגיטלי מול PCR מסורתי." Thermo Fisher Scientific, זמין כאן.

באדיבות התמונה:

1. "PCR" מאת Madprime-יצירה משלו (CC BY-SA 3.0) באמצעות Commons Wikimedia2. "טאקמן" לפי משתמש: Braindamaged - יצירה משלו של ההעלאה המקורית (תחום ציבורי) באמצעות Commons Wikimedia