ההבדל העיקרי-PCR לעומת RT-PCR

PCR ו- RT-PCR הן שתי טכניקות חשובות בביולוגיה מולקולרית. PCR פותחה על ידי קארי מוליס בשנות השמונים. הוא מסוגל להגדיל את מספר העותקים של גן מסוים באופן מעריכי, להקל על זיהוי שבר ה- DNA המסוים הזה. Taq Polymerase הוא האנזים הנפוץ ביותר במערכות PCR. זהו אנזים תרמו -יציב. ב- RT-PCR, שעתוק הפוך ואחריו PCR. האנזים, טרנסקריפטאז הפוך מעורב בסינתזה של DNA משלים מ- RNA. ה ההבדל העיקרי בין PCR ל- RT-PCR זה PCR משתמש ב- DNA דו-גדילי כתבנית ואילו RT-PCR משתמש ב- RNA כתבנית.

אזורי מפתח מכוסים

1. מהו PCR - הגדרה, תהליך, יישום 2. מהו RT PCR - הגדרה, מאפיינים, יישום 3. מה ההבדל בין PCR ל- RT PCR - השוואה בין הבדלים מרכזיים

מונחי מפתח: PCR, RT-PCR, תגובת שרשרת פולימראז, תגובת שרשרת פולימרז בתעתיק הפוך, תבנית DNA, פולימראז DNA, דנטורציה, חישול, הרחבת פריימר

מהו PCR

PCR (תגובת שרשרת פולימראז) היא שיטה פשוטה אך מהפכנית יחסית. PCR משתמש ביכולתו של האנזים, פולימראז DNA לסנתז גדילים חדשים של DNA באופן משלים לגדיל התבנית המוצע. PCR היא טכניקה חיונית המשמשת הן במעבדות קליניות והן במעבדות מחקר לניתוח פונקציונאלי של גנים, אבחון ומעקב אחר מחלות תורשתיות, שיבוט DNA, רצף והגברת DNA עתיקה. תבנית DNA, נוקלאוטידים, פריימרים ופולימראז DNA הם ארבעת המרכיבים העיקריים של ה- PCR. ה תבנית DNA הוא בדרך כלל DNA דו-גדילי בעל רצף המטרה, אותו יש להגביר. Taq DNA פולימראז אשר מבודד מימי תרמוס משמש בדרך כלל ב- PCR. ה פולימראז DNA פו הוא סוג אחר של פולימראז DNA בעל נאמנות גבוהה. פולימראזות טאק ופפו הן עמידות בחום. הנוקלאוטידים שמוסיפים פולימראז ה- DNA הם אדנין (A), גואנין (G), ציטוזין (C) ותימין (T). מכיוון שפולימראז DNA יכול להוסיף רק נוקלאוטיד חדש לקצה 3 'של גדיל DNA קיים, נדרש פריימר אוליגנוקלאוטיד להתחלת סינתזת DNA. הדרישה של פריימר ב- PCR מאפשרת תיחום רק אזור ספציפי בתבנית. רצף המטרות מוקף בפריימרים קדימה ואחורה. בסוף ה- PCR, עותקים חדשים הנקראים amplicons של רצף DNA ספציפי מצטברים במיליארדים. יש לייעל את רכיבי ה- PCR בצורה כזו לשיפור ביצועי ה- PCR תוך צמצום הכשל.

PCR הוא תהליך אוטומטי הנעשה על ידי מחזורי תרמיות, המסוגלים לעבור בין טמפרטורות שונות. PCR הוא תהליך בן שלושה שלבים.

1. דנטורציה -תבנית ה- DNA הדו-גדילית מופרדת לשני גדילים בודדים על ידי חימום ל-94-95 מעלות צלזיוס.
2. רִכּוּך - הפריימרים קדימה ואחורה נקשרים לרצפים המשלימים בתבנית. הטמפרטורה של שלב זה תלויה בטמפרטורת ההיתוך של שילוב הפריימר.
3. הארכת פריימר - אנזים ה- DNA פולימראז מאריך כל אחד מהפריימרים בסוף ה -3 שלהם על ידי הוספת בסיסים משלימים לגדיל הגדל. הטמפרטורה האופטימלית של טאק פולימראז, 72 ° C משמשת כטמפרטורה בשלב ההרחבה. זמן ההרחבה תלוי במספר זוגות הבסיס בגדיל התבנית.

שלושת השלבים חוזרים על עצמם במשך 28-35 פעמים.

איור 1: תגובת שרשרת פולימראז

המוצרים של ה- PCR מחולקים בגודל על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose בהשוואה לסולם DNA. ההדמיה של ה- DNA על ג'ל agarose נעשית על ידי מכתים באתידיום ברומיד והתבוננות תחת UV. להקות ה- DNA המוגברות תחת UV בג'ל מוכתם אתידיום ברומיד מוצגות באיור 2. סולם ה- DNA מוצג בבאר השמאלית ביותר.

איור 2: להקות DNA

מהו RT-PCR

RT-PCR (תגובת שרשרת הפוכה של תעתיק-פולימראז) היא אחת הטכניקות הרגישות ביותר המשמשות לאיתור mRNA. RNA היא התבנית המתאימה לאיסוף מידע על ביטוי הגן של רקמה רגילה או ביטוי הגן של רקמה נגוע. התבנית עבור ה- RT-PCR יכולה להיות RNA כולל או RNA ויראלי או חיידקי בהתאמה. RNA מועתק הפוך ל- DNA משלים (cDNA) על ידי האנזים, transcriptase הפוך. הטמפרטורה האופטימלית של טרנסקריפטאז הפוך היא 46 מעלות צלזיוס. ה- cDNA משמש ב- PCR על מנת להשיג את המוצר. שלבים ב- PCR שעתוק הפוך מוצגים באיור 3.

איור 3: RT-PCR

ניתן לבצע RT-PCR בתגובות של שני שלבים או שלבים. בתגובה הדו-שלבית, התמלול ההפוך ו- PCR מבוצעים בשני שלבים נפרדים. ב RT-PCR שלב אחד, שעתוק הפוך ואחריו PCR בצינור יחיד באופן רציף. הן cDNA והן מוצר ה- PCR הסופי ניתנים להפעלה על ג'ל agarose למטרות חלוקת הגודל וההדמיה. שלב אחד ושני שלבים RT-PCR מוצגים באיור 4.

איור 4: שלב אחד ושני שלבים RT-PCR

ההבדל בין PCR ל- RT-PCR

הַגדָרָה

PCR: PCR היא טכניקה המשמשת בביולוגיה מולקולרית להגברת קטע של DNA המייצר מיליוני עותקים של רצף DNA.

RT-PCR: RT-PCR הוא גרסה של PCR המשמשת לאיתור ביטוי גנים בביולוגיה מולקולרית.

צעדים

PCR: דנטורציה, חישול והרחבה הם שלושת השלבים ב- PCR.

RT-PCR: ב- RT-PCR, שעתוק הפוך ואחריו PCR.

תבנית

PCR: מולקולת DNA דו-גדילית משמשת כתבנית ל- PCR.

RT-PCR: מולקולת RNA חד גדילית משמשת כתבנית לתמלול הפוך. מולקולת DNA חד גדילית משמשת כתבנית ה- PCR.

אנזימים בשימוש

PCR: פולימראז DNA משמש כאנזים ב- PCR.

RT-PCR: טרנסקריפטאז הפוך ופולימראז DNA משמשים כאנזימים ב- RT-PCR.

פריימרים

PCR: פריימרים קדימה ואחורה משמשים ב- PCR.

RT-PCR: רק הפריימר ההפוך משמש לשעתוק הפוך וגם פריימרים קדימה וגם הפוך משמשים ב- PCR.

רְגִישׁוּת

PCR: PCR היא שיטה רגישה.

RT-PCR: RT-PCR רגיש יותר מזה PCR.

יישומים

PCR: PCR משמש לניתוח תפקודי של גנים, אבחון ומעקב אחר מחלות תורשתיות, שיבוט DNA, רצף DNA והגברת DNA עתיקה.

RT-PCR: RT-PCR משמש לאיתור ביטוי גנים.

סיכום

PCR ו- RT-PCR הן שתי הטכניקות החשובות המשמשות את הביולוגיה המולקולרית. הן PCR והן RT-PCR הן טכניקות אוטומטיות המסוגלות להגדיל באופן אקספוננציאלי את מספר העותקים של רצף ה- DNA היעד, המוגדר על ידי הפריימרים קדימה ואחורה. ב- PCR, DNA דו-גדילי משמש כתבנית. על ידי PCR, ניתן לבצע שיבוט DNA, רצף DNA וניתוח פונקציונאלי של הגנים. ב- RT-PCR ניתן לראות ביטוי גנים ברקמה מסוימת על ידי הגברת RNA. ההבדל העיקרי בין PCR ל- RT-PCR הוא בתבניות שלהם המשמשות בכל תגובה וביישומים שלהן.

התייחסות:

1. "תגובת שרשרת פולימראז (PCR)." המרכז הלאומי למידע על ביוטכנולוגיה. הספרייה הלאומית לרפואה של ארה"ב, nd אינטרנט. זמין פה. 01 ביוני 2017. 2. "תגובת שרשרת פולימראז (או PCR)." שיבוט וניתוח מולקולרי של גנים. נ.פ., נ.ד. אינטרנט. זמין פה. 01 ביוני 2017. 3. ביולאבס, ניו אינגלנד. "סינתזה של CDNA ו- RT-PCR." סינתזה של CDNA ו- RT-PCR | חוֹד. נ.פ., נ.ד. אינטרנט. זמין פה. 01 ביוני 2017.

באדיבות התמונה:

1. "תגובת שרשרת פולימראז" מאת Enzoklop-עבודה משלו (CC BY-SA 3.0) באמצעות Commons Wikimedia 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." מאת רייניס ונטה-יצירה משלו (CC BY-SA 3.0) באמצעות Commons Wikimedia 3. "תגובת שרשרת פולימראז של תעתיק הפוך" מאת Jpark623-עבודה משלו (CC BY-SA 3.0) באמצעות Commons Wikimedia 4. "שלב אחד מול דו-שלבי RT-PCR ”מאת Jpark623-יצירה משלו (CC BY-SA 3.0) באמצעות Commons Wikimedia